Prosedur pewarnaan Gram adalah suatu pemeriksaan rutin dalam bidang mikrobiologi. Tujuannya untuk membedakan bakteri menjadi dua kelompok utama, Gram-positif dan Gram-negatif. Metode ini dikembangkan oleh bakteriolog Denmark Hans Christian Gram pada tahun 1884 saat ia bekerja di Berlin bersama Carl Friedländer. Tujuan awal Gram adalah untuk membuat bakteri lebih terlihat dalam spesimen jaringan, terutama pada jaringan paru-paru dari pasien yang meninggal karena pneumonia.
Gram menemukan bahwa dengan menerapkan serangkaian pewarna dijumpai perbedaan mencolok antara jenis bakteri. Zat warna yang digunakan meliputi kristal violet, diikuti oleh yodium, alkohol (sebagai peluntur), dan suatu pewarna kontras. Bakteri Gram-positif mempertahankan pewarna ungu karena dinding sel peptidoglikan yang tebal, sementara bakteri Gram-negatif, yang memiliki dinding sel lebih tipis dan kandungan lipid lebih tinggi, tidak mempertahankan pewarna ungu setelah dekolorisasi warna dan malah menyerap pewarna kontras.
Pewarnaan Gram dengan cepat menjadi populer karena perannya dalam diagnosis. Pemeriksaan ini menjadi langkah pertama dalam klasifikasi dan identifikasi banyak bakteri. Segera setelah publikasinya, teknik ini digunakan untuk mempelajari berbagai penyakit, termasuk tifus, kolera, dan gonore, dan menjadi pemeriksaan standar di laboratorium klinis. Perbedaan antara bakteri Gram-positif dan Gram-negatif tetap krusial tidak hanya untuk identifikasi bakteri tetapi juga untuk menentukan pengobatan antibiotik yang tepat, karena banyak obat hanya menargetkan salah satu kelompok bakteri tersebut.
Teknik asli yang dikembangkan oleh Hans Christian Gram menggunakan Bismarck brown sebagai pewarna kontras. Gram sendiri mengakui keterbatasan awal metode pewarnaannya, tetapi kegunaannya segera menjadi pesat saat mikrobiolog di seluruh dunia mengadopsi dan menyempurnakan teknik tersebut. Kemudian, seorang patolog Jerman Carl Weigert menyempurnakan metode tersebut dengan mengganti Bismarck brown dengan safranin. Carl Weigert memainkan peran penting dalam menyempurnakan teknik pewarnaan ini. Gram menemukan metode pewarnaan pada tahun 1883, Weigert selanjutnya memperbaiki prosedur tersebut dengan memperkenalkan penggunaan safranin sebagai pewarna kontras pada langkah akhir. Lebih dari satu abad kemudian, pewarnaan Gram tetap menjadi teknik sentral dan tak tergantikan dalam bidang mikrobiologi klinis.
Ada beberapa modifikasi yang diketahui dari prosedur pewarnaan Gram di luar metode aslinya, dengan tujuan untuk meningkatkan perbedaan, kualitas pewarnaan, atau menyesuaikan dengan jenis spesimen tertentu. Beberapa modifikasi tersebut meliputi:
- Pewarnaan Gram Twort. Modifikasi Twort memperkenalkan perubahan prosedur untuk meningkatkan kejernihan pewarnaan, meskipun saat ini kurang umum digunakan. Pemeriksaan ini direkomendasikan untuk pemeriksaan histopatologi jaringan. Secara historis, modifikasi ini diakui karena menyesuaikan beberapa langkah dari protokol asli untuk visualisasi yang lebih baik pada kelompok bakteri tertentu.
- Modifikasi Brown-Brenn dan Taylor. Pewarnaan ini juga digunakan khusus untuk irisan jaringan, modifikasi ini menambahkan ammonium oxalate untuk mencegah presipitasi kristal violet dan menggunakan langkah dekolorisasi yang berbeda (ethanol diganti acetone) untuk mengurangi dekolorisasi berlebihan pada bakteri yang tertanam dalam jaringan. Basic fuchsin digunakan sebagai pewarna kontras menggantikan safranin, dan asam picric-acetone mewarnai komponen jaringan untuk kontras yang lebih baik.
- Modifikasi Pewarnaan Gram dengan Campuran Aseton-Alkohol. Modifikasi ini mengganti aseton murni dengan campuran aseton-alkohol sebagai peluntur zat warna utama. Hal ini meningkatkan efek penghilangan warna, menghasilkan intensitas pewarnaan yang lebih baik dan visualisasi bakteri yang lebih jelas, terutama pada sampel plak gingiva. Waktu pewarnaan kontras juga dikurangi untuk visualisasi lebih baik.
- Modifikasi Burke. Modifikasi ini menambahkan natrium bikarbonat ke larutan pewarna kristal violet untuk meningkatkan pewarnaan bakteri yang bersifat gram-variabel akibat kerentanan dinding selnya selama pembelahan.
- Pewarnaan Gram Fluoresensi. Pendekatan modern yang menggunakan probe fluoresensi yang secara selektif mengikat bakteri Gram-positif atau Gram-negatif, memungkinkan untuk membedakan bakteri hidup dengan sensitivitas dan spesifisitas tinggi melalui mikroskopi fluoresensi.
- Pewarnaan Gram Atkin. Beberapa laboratorium menggunakan modifikasi eksklusif atau khusus seperti pewarnaan Atkin, yang mengubah konsentrasi reagen atau langkah-langkah untuk meningkatkan pemisahan atau menyesuaikan dengan alat pewarnaan otomatis.
- Otomatisasi. Alat pewarnaan Gram otomatis telah dikembangkan untuk mengurangi variasi manual dan mempercepat proses pewarnaan, meskipun umumnya menggunakan reagen dan langkah-langkah pewarnaan Gram standar atau sedikit dimodifikasi.
Modifikasi prosedur pewarnaan Gram sering berfokus pada peningkatan kejernihan pewarnaan, mengurangi pewarnaan berlebihan atau kurang, menyesuaikan dengan jenis spesimen tertentu (jaringan atau smear), atau memfasilitasi deteksi lanjutan seperti penandaan fluoresensi. Pewarnaan Gram Twort adalah salah satu varian prosedural historis, dengan varian lain termasuk Brown-Brenn, Burke’s, dan modifikasi aseton-alkohol, serta teknik fluoresensi modern.
Pewarnaan Gram sangat penting dalam setting klinis karena beberapa alasan, menjadikannya alat yang tak tergantikan dalam mikrobiologi diagnostik. Teknik ini berperan penting dalam identifikasi cepat infeksi bakteri, panduan terapi antibiotik awal, diagnosis pada berbagai jenis infeksi, penilaian kualitas sampel dan keparahan infeksi. Deteksi patogen jamur dan patogen langka, mendukung pengendalian infeksi dan epidemiologi, efisiensi biaya, dan kecepatan pemeriksaan. Pewarnaan Gram tetap menjadi salah satu tes awal yang paling penting dan paling banyak digunakan di laboratorium klinis. Kemampuannya untuk dengan cepat mengarahkan terapi awal dan keputusan diagnostik secara langsung mempengaruhi hasil pengobatan pasien, terutama pada infeksi akut atau yang mengancam nyawa.
To sum up, pewarnaan Gram tidak hanya menjadi tonggak penting dalam sejarah mikrobiologi, tetapi juga tetap relevan dan tak tergantikan dalam praktik klinis modern. Terlepas dari kemajuan teknologi mikrobiologi diagnostik, prosedur ini terus digunakan secara luas karena kesederhanaannya, kecepatan hasil, dan nilai klinis yang tinggi dalam membedakan karakteristik utama bakteri. Beragam modifikasi yang telah dikembangkan sepanjang waktu mencerminkan fleksibilitas metode ini terhadap kebutuhan laboratorium yang terus berkembang. Dengan demikian, pewarnaan Gram bukan sekadar teknik pewarnaan, melainkan fondasi penting dalam pengambilan keputusan medis berbasis laboratorium.